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Colorazione di Gram: l’esame diagnostico per la definizione delle infezioni batteriche

La colorazione di Gram è un esame di laboratorio che permette, attraverso dei particolari pigmenti, di distinguere fra le due principali tipologie di batteri, ovvero i Gram positivi e i Gram negativi. L’esame diagnostico si può eseguire su batteri in coltura o direttamente presenti sui tessuti. In base al tipo di risultato, un paziente può essere sottoposto a terapie diverse.

La colorazione di Gram è un esame di laboratorio che permette, attraverso dei particolari pigmenti, di distinguere fra le due principali tipologie di batteri, ovvero i Gram positivi e i Gram negativi. L’esame diagnostico si può eseguire su batteri in coltura o direttamente presenti sui tessuti. In base al tipo di risultato, un paziente può essere sottoposto a terapie diverse.

Che cos’è la colorazione di Gram

La colorazione di gram è un tipo di esame di laboratorio molto importante in campo medico. La colorazione di Gram è sicuramente il metodo più importante per la colorazione batterica differenziale, ovvero che utilizza coloranti per la classificazione dei batteri, che si distinguono fra Gram positivi (Gram+) e Gram negativi (Gram-). Questo metodo fu messo a punto fra il 1882 ed il 1884 da un medico di origini danesi di nome Hans Joachim Chrisian Gram (1853-1938), allo scopo di distinguere lo Streptococcus pneumoniae dalla Klebsiella pneumoniae.

I batteri della specie Gram negativi di solito sono dei batteri patogeni che determinano l’insorgenza di problemi più gravi rispetto ai Gram positivi. Oltretutto proprio per la loro membrana esterna, impediscono a molti antibiotici di intervenire su di essi. Per questo il tipo negativo è più resistente ai farmaci e sono più difficili da debellare.

A cosa serve questo test

La colorazione di Gram, con l’esame culturale, sono gli esami microbiologici più diffusi per determinare la causa di un’infezione batterica. Le colorazioni, infatti, hanno la capacità di mettere in evidenza le proprietà della parete cellulare dei microrganismi, distinguendone la tipologia. Anche solo grazie a questo esame è possibile prescrivere un trattamento antibiotico da fare nell’attesa di esami più dettagliati. Con questo metodo si è soliti esaminare sia i batteri in coltura, che quelli presenti su frammenti di tessuti. In base ai risultati di questo esame diagnostico è possibile sapere che tipo di intervento fare quando è presente un’infezione batterica, per questo viene prescritto ai pazienti in cui potrebbe essere in corso un’infezione.

Come funziona: il procedimento d’esame

come funziona la colorazione di gram

La colorazione utilizza diversi coloranti in tempi successivi. Nello specifico il preparato che contiene i batteri viene trattato prima con una soluzione di cristalvioletto per circa due o tre minuti. Una volta trascorso questo tempo, si allontana il colorante e si usa un mordenzatore. Questa sostanza permette al colorante di legarsi in modo stabile al substrato, cosa che di solito avviene con difficoltà poiché fra i coloranti e le strutture delle cellule non c’è grande affinità. Il mordenzatore molto spesso è il liquido di Lugol, ovvero una sostanza costituita da una soluzione di iodio e ioduro di potassio in acqua. É sufficiente mettere il preparato a contatto con questa soluzione per un minuto per ottenere l’effetto desiderato.

A questo punto il preparato con i batteri viene trattato per un paio di minuti con un decolorante, ovvero con alcol etilico o con acetone. Successivamente subisce un altro passaggio colorante di tipo diverso, per differenziare così i batteri con un altro colore. Il secondo colorante utilizzato è di solito la fuxina o la sufranina, che dà un colore rosso ben distinguibile dal colore violaceo del cristalvioletto. Al termine di questa seconda fase di colorazione, alcuni batteri hanno una colorazione viola: il decolorante non ha rimosso il colore. Queste cellule sono i Gram positivi, mentre quelle che appaiono in rosso grazie alla seconda colorazione, sono i Gram negativi.

I risultati dell’esame di laboratorio

Una volta eseguito tutto il procedimento, la soluzione con i batteri sottoposta a colorazione di Gram, viene indagata con il microscopio ottico. A questo punto si possono distinguere due tipologie di batteri: i Gram positivi ed i Gram negativi.

Riassumendo, al termine dell’esame della colorazione di Gram risultano:

  • Gram positivi con una colorazione color viola genziana.
  • Gram negativi che hanno una colorazione fra il rosa e il rosso.

Le motivazioni alla base di questi risultati sono semplici. I batteri Gram positivi presentano una parete cellulare idrofobica. Se quindi il cristalvioletto e lo iodio nella soluzione di Lugol penetrano nella cellula, grazie all’idrofilia, il complesso all’interno della cellula ha caratteristiche idrofobiche che non gli permettono di riattraversare la parete delle cellule per essere estratto dai decoloranti. Osservando i batteri al microscopio, è possibile fare un confronto con le immagini di riferimento per cercare di capire di quale batteri si tratta. La forma e la colorazione di Gram possono rendere l’identificazione semplice. I database con i batteri più comuni dal punto di vista medico sono catalogati proprio a partire dal Gram.

I batteri Gram positivi più comuni sono i cocchi, con forma sferica, o i bastoncelli, con forma cilindrica. Fra i cocchi ci sono per esempio gli stafilococchi (riuniti a gruppi) e gli streptococchi (riuniti a catene). Fra i bastoncelli Gram positivi invece sono diffusi il Bacillus, il Clostridium, la Listeria, il Corynebacterium. I batteri Gram negativi si distinguono fra cocchi, bastoncelli e coccoidi, una via di mezzo fra lo sferico ed il cilindrico. I cocchi Gram Negativi più comuni sono quelli del tipo Neisseria. Per i bastoncelli invece ci sono l’Escherichia Coli, l’enterobacter, la Klebsiella, il Citrobacter, la Salmonella, il Proteus, la Serratia, la Shigella, gli Pseudomonas e altri. I coccoidi più diffusi sono invece la Bordatella, la Brucella, la Pasteurella, l’Haemophilus.

Risultati particolari del test

Risultati particolari del test

In alcuni casi la Colorazione di Gram può dare risultati misti. Alcuni batteri sono infatti particolari ed è difficile identificarli perché mostrano una colorazione mista o medesimi batteri con colorazioni diverse e opposte. I campioni vecchi di oltre 24 ore presentano quasi sempre questo problema, ma le motivazioni possono anche essere altre.

Alcuni batteri sono difficilmente individuabili con il Gram test, di conseguenza bisogna adottare altri metodi diagnostici, come la colorazione Ziehl Neelsen, l’osservazione in coltura, il TSI Agar, i test genetici. Batteri che possono più spesso di altri presentare colorazioni anomale e poco chiare sono l’Actimomyces, l’Arthobacter, il Corynebacterium, il Mycobacterium, il Propionibacterium. In alcuni casi a creare difficoltà è la dimensione ridotta dei batteri: il Treponema, la Chlamydia, il Rickettsia sono talmente piccoli e sottili che si colorano con difficoltà con la tecnica di Gram.

Anche se a volte il test della colorazione di Gram può dare dei risultati anomali e questi possono dipendere da molteplici fattori, quali l’età della colonia, le condizioni di crescita e simili, questo esame di laboratorio rimane una tecnica fra le più utilizzate in batteriologia.